結(jié)核病診斷技術(shù)

新進(jìn)展 | 結(jié)核分枝桿菌感染的診斷方法2015-04-11 醫(yī)學(xué)界感染頻道

來源：檢驗(yàn)視界網(wǎng)

結(jié)核病是人類最古老的傳染病之一， 是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，至今依然是單一感染因素引起死亡人數(shù)最多的疾病。我國的結(jié)核發(fā)病率位于世界第二，感染率為44.5％?，F(xiàn)有的結(jié)核診斷方法存在諸多不足。臨床癥狀和影像學(xué)特征有助于疑似患者的發(fā)現(xiàn)，但進(jìn)一步診斷需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測。結(jié)核現(xiàn)有早期診斷手段有涂片鏡檢和分子檢測等方法。涂片鏡檢雖然使用廣泛，但敏感度低且易受非結(jié)核分枝桿菌的干擾。而MTB的分子學(xué)診斷雖然在涂陽標(biāo)本中檢出率高，但只能檢出50％左右的涂陰標(biāo)本，且分子診斷操作復(fù)雜、容易交叉污染，也在一定程度上限制了其在基層的推廣應(yīng)用。MTB分離培養(yǎng)是目前結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，不僅具有較高的檢出率，且能對菌種進(jìn)行鑒定，但耗時(shí)較長（一般需培養(yǎng)6-8周），作為早期診斷的意義不大。MTB感染后機(jī)體主要的免疫反應(yīng)為T細(xì)胞免疫，其血清抗體檢測的意義不大。

全球結(jié)核菌感染者中，超過95％表現(xiàn)為潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）。LTBI仍可發(fā)展為活動性結(jié)核，成為主要的傳染源。因此，準(zhǔn)確診斷結(jié)核菌潛伏感染，對于結(jié)核病的預(yù)防具有十分重要的意義。由于潛伏感染者缺乏特異性癥狀，而且目前診斷結(jié)核潛伏感染還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此很難在健康人群中快速檢測出結(jié)核潛伏感染患者，特別是在其臨床癥狀還沒有出現(xiàn)時(shí)。

結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)

臨床上用于判斷結(jié)核分枝桿菌感染的首選方法是TST（tuberculin skin test，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)），即皮內(nèi)Mantoux試驗(yàn)以及PPD試驗(yàn)，主要以純化蛋白衍生物（PPD）和舊結(jié)核菌素（OT）為抗原進(jìn)行皮下注射的診斷方法。TST從1890年發(fā)明以來沿用至今，用于結(jié)核病的診斷已超過100年，是目前還在應(yīng)用中的一種古老的試驗(yàn)方法。目前國內(nèi)診斷潛伏感染主要依據(jù)結(jié)核菌素皮試（PPD皮試）的結(jié)果，一般將PPD強(qiáng)陽性或短期內(nèi)從陰性轉(zhuǎn)為陽性，而無臨床結(jié)核病證據(jù)者判斷為結(jié)核菌潛伏感染者。此法所需費(fèi)用較少，簡單易行。

TST的缺點(diǎn)首先是特異性不夠好。PPD是從結(jié)核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，包含200多種蛋白，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介菌（BCG）的共同抗原成分。對于卡介苗（BCG）作為常規(guī)接種疫苗的國家，TST的陽性或者弱陽性結(jié)果很可能是由BCG接種引起的，同時(shí)不能除外非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染。在中國結(jié)核病高度流行地區(qū)，由于廣泛接種BCG，TST會造成假陽性；而在HIV感染患者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下的人群中容易出現(xiàn)假陰性。其次，TST對潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI）的敏感性一般，而且對于免疫抑制者結(jié)果難以確定。另外，TST檢測還存在費(fèi)時(shí)（48-72小時(shí)）、需要受試者回訪、皮試操作和結(jié)果解釋存在主觀依賴性等缺點(diǎn)。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)

近年來，有一類用于診斷結(jié)核分枝桿菌感染的新方法進(jìn)入了人們的視線，即γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA），這類試驗(yàn)采用ELISA／ELISPOT（酶聯(lián)免疫吸附/酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)）方法定量檢測檢測全血/外周血單核細(xì)胞在結(jié)核菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染以及結(jié)核病。目前這類γ-干擾素釋放試驗(yàn)中，有兩種較為成熟的方法，即Quanti FERON-TB GOLD試驗(yàn)（QFT-G）和T-SPOT TB試驗(yàn)。其對應(yīng)的方法和試劑盒先后被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，CDC為其指定了使用指南。

IGRA的理論和基礎(chǔ)研究

人體對于結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫。T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用關(guān)系到感染的進(jìn)程和演變。巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后，就會把它們消化成大小不一的片斷。特異片斷（抗原肽）與巨噬細(xì)胞和其他抗原遞呈細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體（人白細(xì)胞抗原）相結(jié)合，表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，并遞呈給T細(xì)胞。特異性CD4 T細(xì)胞能產(chǎn)生特征性淋巴因子，包括一種能夠刺激T細(xì)胞增殖的生長因子白介素-2和一種巨噬細(xì)胞反應(yīng)中介物γ-干擾素，γ-干擾素為巨噬細(xì)胞殺菌機(jī)制所必需。

IGRA將結(jié)核菌特異性抗原加入受試者的血液標(biāo)本或者含有分離出的外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵化，如果受試者受到過結(jié)核分枝桿菌感染，那么被結(jié)核菌激活的記憶T細(xì)胞就會對這些特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生增殖分化并釋放出γ-干擾素以及其他一些細(xì)胞因子，我們可以通過ELISA/ELISPOT方法定量檢測γ-干擾素的釋放水平。通過這樣的試驗(yàn)，我們可以診斷是否存在結(jié)核菌感染。IFN-γ為Th1細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，不但能夠反映機(jī)體結(jié)核的Th1細(xì)胞免疫情況，還與體內(nèi)結(jié)核菌的抗原含量密切相關(guān)。被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏的T細(xì)胞再遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生高水平的IFN-γ，因此被用于結(jié)核潛伏感染的診斷。

整個(gè)試驗(yàn)體系中，對于結(jié)核菌特異性抗原的選定是至關(guān)重要的。γ-干擾素釋放試驗(yàn)誕生的早期曾使用PPD作為特異性抗原，由于PPD成分不單一，特異性和敏感性均不理想。后來研究者開始使用ESAT-6和CFP.10作為抗原，得到了較好的效果。ESAT-6（早期分泌抗原靶6 000蛋白，early secretory antigenic target 6）和CFP-10（培養(yǎng)濾出液蛋白-10，culture filtrate protein 10）的蛋白編碼來源于結(jié)核分枝桿菌基因中的一個(gè)菌種特異性基因片斷，稱為region of difference 1（RD1）。這個(gè)基因片斷不存在于大部分的非結(jié)核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌（包括卡介苗）中，因此ESAT-6和CFP.10作為抗原的特異性相對于PPD要高的多，這個(gè)顯著的優(yōu)異性也使得γ-干擾素釋放試驗(yàn)得以應(yīng)用于臨床。

目前QuantiFERON-TB GOLD和T-SPOT TB的試劑盒主要以這兩種抗原為基礎(chǔ)。其中，QFT-G又出現(xiàn)了一種用試管的改良方法，稱為QFTGIT（QFT-in Tube）。某些TIGRA試驗(yàn)除了上述兩種抗原外，還常用TB7.7抗原。TB7.7是結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)13（RD13）基因編碼的結(jié)核桿菌特異性抗原團(tuán)。這三種抗原在BCG和絕大部分環(huán)境分枝桿菌中都缺失（除外堪薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌），因此避免了與卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌抗原的交叉反應(yīng)。

此外，對于新抗原的研究開發(fā)依然沒有停止，近年來發(fā)現(xiàn)的肝磷脂結(jié)合紅血球凝集素（Heparin-Binding-Hemagglutinin，HBHA）是新一代結(jié)核菌特異性抗原中較為突出的一個(gè)。這是一種結(jié)核分枝桿菌表面蛋白，其作用和結(jié)核的潛伏感染相關(guān)。潛伏感染者會對于HAHB產(chǎn)生強(qiáng)烈T細(xì)胞反應(yīng)，而活動性肺結(jié)核則不會，因此這是一個(gè)非常有潛力的新抗原。

IGRA的應(yīng)用

IGRA目前還只在少數(shù)國家被應(yīng)用于臨床，主要是用于檢測結(jié)核菌潛伏感染，此外該試驗(yàn)還被用于活動性肺結(jié)核的診斷、預(yù)測和鑒別診斷。近年來，一些使用IGRA檢測胸水以及支氣管肺泡灌洗液中的T細(xì)胞反應(yīng)以檢測結(jié)核分枝桿菌感染的試驗(yàn)也取得了較好的效果，為這類試驗(yàn)的應(yīng)用拓展了新思路。

1、篩選結(jié)核菌潛伏感染

篩選結(jié)核菌潛伏感染是IGRA最成熟的應(yīng)用領(lǐng)域。在這方面IGRA比TST的特異性要高，尤其是對于卡介苗接種過的人和NTM感染者。大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，對于潛伏感染，IGRA試驗(yàn)的特異性在90％以上，對于低危險(xiǎn)人群的特異性則達(dá)到了95％以上。

目前對于結(jié)核潛伏感染的敏感性難以確定，因?yàn)闆]有一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)能判斷是否真的有潛伏感染。不同地區(qū)的相關(guān)報(bào)道結(jié)果有較大的差異，高危人群和低危人群有所不同。

2、診斷活動性結(jié)核

IGRA難以區(qū)別近期結(jié)核分枝桿菌感染與活動性結(jié)核病，但是用于活動性結(jié)核與其它疾病的鑒別很有意義。大量數(shù)據(jù)提示，QFT-G試驗(yàn)的敏感性從55％-88％不等，平均大概75％左右。這個(gè)和TST（平均77％）差不多。而T-SPOT的敏感性比QFT-G高，因?yàn)樵撛囼?yàn)檢測到的干擾素就在產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞周圍（一旦產(chǎn)生，就被結(jié)合了），而QFT-G試驗(yàn)檢測到的是已經(jīng)彌散在反應(yīng)體系中的干擾素。

由于胸水中免疫反應(yīng)的強(qiáng)度比血液中更高，因此有些試驗(yàn)通過檢測胸水中的γ-干擾素釋放水平來診斷活動性胸膜結(jié)核，這些嘗試被證實(shí)是有意義的。

腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-γ的治療會導(dǎo)致潛伏性肺結(jié)核轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有?a href='http://genefish.cn/jb/fjh'>肺結(jié)核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制，TST容易產(chǎn)生假陰性。研究顯示，QFT-G和T-genefish.cn在免疫介導(dǎo)炎癥疾?。↖MID）患者中檢測LTBI的敏感性和特異性都比TST高。終末期腎病（ESRD）患者感染結(jié)核分枝桿菌的幾率比健康人高10-25.3倍。

3、確診陽性或者弱陽性的PPD結(jié)果

由于對于潛伏感染的特異性要比TST高的多，因此IGRA用來確認(rèn)一個(gè)陽性或者弱陽性的PPD結(jié)果是很有意義的，尤其是對于BCG接種者、確診或者疑似的NTM感染者以及面臨預(yù)防性抗癆的患者。

關(guān)于IGRA的可重復(fù)性，有較多的相關(guān)試驗(yàn)均表明，IGRA并無助強(qiáng)效應(yīng)（booster phenomenon）以及類似反應(yīng)，可以反復(fù)進(jìn)行。2003年美國CDC發(fā)布的指南中提到，使用PPD進(jìn)行TST檢測以后會影響QFT（第一代）的結(jié)果，因此QFT不能作為TST的補(bǔ)充診斷；但是后來2005年發(fā)布的關(guān)于QFT-G的相關(guān)指南就沒有提到這個(gè)問題，可能是因?yàn)楹髞硎褂昧似渌乖鍼PD以后，就沒有了互相影響。目前關(guān)于IGRA確診陽性或者弱陽性的PPD結(jié)果的實(shí)際效果還沒有得到大量臨床資料證實(shí)。

TIGRA和TST的比較

評價(jià)結(jié)核潛伏感染診斷方法的最大問題是缺乏結(jié)核潛伏感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，無法直接測量QFT-GIT、T-genefish.cn和TST方法的敏感性和特異性。許多研究都比較了QFT-GIT、T-genefish.cn和TST方法在結(jié)核診斷中的表現(xiàn)。QFT-GIT和T-genefish.cn結(jié)果具有統(tǒng)一性，它們都比TST更準(zhǔn)確。許多研究結(jié)果顯示QFT-GIT可以取代或輔助TST對LTBI的診斷。TIGRA比TST更敏感、特異性更強(qiáng)。因?yàn)門IGRA所用抗原是結(jié)核分枝桿菌所特有的，而且其操作過程和實(shí)驗(yàn)原理更加完善和先進(jìn)。

TIGRA的敏感性和特異性都強(qiáng)于TST，特別是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下人群的檢測中。全球有約1300萬人共同感染了HIV和結(jié)核桿菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易從潛伏感染發(fā)展為活動性肺結(jié)核。

TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的兒童中，對LTBI的檢出率更高。但是，TIGRA存在無法區(qū)分活動期和潛伏期結(jié)核、需要抽血獲取淋巴細(xì)胞、要求專業(yè)的操作人員和具備相應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)室、樣品必須在采集后8h內(nèi)完成等缺點(diǎn)，現(xiàn)階段仍未能完全取代TST。另外，現(xiàn)階段研究的樣本都非常小，也沒有診斷LTBI的金標(biāo)準(zhǔn)。

IGRA的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

1、IGRA的優(yōu)點(diǎn)

IGRA用于判斷結(jié)核菌感染的特異性明顯高于TST試驗(yàn)，并且不受卡介苗接種的影響，這對于結(jié)核的診斷和預(yù)防是非常有意義的，尤其是在卡介苗接種率高的國家。這個(gè)試驗(yàn)在24小時(shí)之內(nèi)就可以獲得結(jié)果，花費(fèi)的時(shí)間比TST短，并且不會因?yàn)橹鷱?qiáng)效應(yīng)受到影響，可以反復(fù)進(jìn)行；此外，該試驗(yàn)受到主觀因素的影響相對較小。在有試驗(yàn)條件的醫(yī)院里，該實(shí)驗(yàn)的操作和管理比TST更便捷，不需要專門的醫(yī)生多次觀察結(jié)果。

2、IGRA的缺點(diǎn)

對于我國目前的醫(yī)療背景來說，該試驗(yàn)最大的缺點(diǎn)就是試驗(yàn)成本高，這限制了該試驗(yàn)的推廣。目前該試驗(yàn)在我國國內(nèi)的試驗(yàn)資料非常少，對于我國人群的判斷標(biāo)準(zhǔn)還沒有定論，同時(shí)該試驗(yàn)對于試驗(yàn)室基礎(chǔ)條件也有一定要求。

此外，該試驗(yàn)還有一些固有的缺點(diǎn)：首先，時(shí)間窗較窄，因?yàn)檠?xì)胞在體外活性迅速減弱，因此8小時(shí)內(nèi)必須在標(biāo)本里加入抗原進(jìn)行孵化；其次，該試驗(yàn)對于結(jié)核近期感染和活動性結(jié)核的鑒別能力較差。雖然有報(bào)道稱使用HBHA作為抗原可以明確鑒別結(jié)核分枝桿菌感染和活動性結(jié)核，但是缺少足夠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

該試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上受到T細(xì)胞水平的影響，對于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會結(jié)果不準(zhǔn)確，此外對于某些血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，也缺少足夠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。雖然有資料表明，干擾素釋放試驗(yàn)對于HIV患者感染結(jié)核菌也有診斷價(jià)值，但是沒有足夠的臨床研究證實(shí)。

其他潛伏感染診斷標(biāo)志物和方法

結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的相關(guān)蛋白可以作為血清學(xué)標(biāo)志物。Hsp16.3是由結(jié)核分枝桿菌hspX基因編碼的蛋白，最初被認(rèn)為是免疫顯性抗原，后來被確認(rèn)是一個(gè)重要的膜抗原，它的表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌的休眠密切相關(guān)。肝素結(jié)合血凝素（HBHA）是結(jié)核分枝桿菌的表面蛋白，它可以引發(fā)細(xì)菌的聚集和吸附于非吞噬細(xì)胞。TIGRA不能百分之百地檢測到LTBI，因?yàn)镋SAT-6和CFP-10在潛伏感染時(shí)不是高表達(dá)的。NarX和NarK2在BCG中不表達(dá)，但在潛伏期的結(jié)核感染中表達(dá)。因此，它們對LTBI的檢測更敏感，而且它們可以區(qū)分潛伏感染和BCG接種。CFP21和MPT64是由RD2編碼的結(jié)核分枝桿菌特有的診斷性質(zhì)抗原。

IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10（IP10，又名CXCL-10）其相對分子質(zhì)量約為10?10^3。IP10是CXC家族的趨化因子，對T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等有較強(qiáng)的趨化和功能活化作用，對于正常生理?xiàng)l件下淋巴細(xì)胞的循環(huán)、代謝和數(shù)量的穩(wěn)定，以及免疫損傷局部對淋巴細(xì)胞的趨化均有重要作用。IP10還廣泛參于某些病理生理過程，如調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化發(fā)育、體內(nèi)的遷移和分布等。IP10在趨化效應(yīng)T細(xì)胞到Th1型細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥部位中發(fā)揮重要作用。

TIGRA通過測量IFN-γ的釋放量來診斷LTBI。白細(xì)胞介素7（IL-7）是一種細(xì)胞因子，能夠穩(wěn)定IFN-γ的分泌和提高蛋白產(chǎn)量。用IL-7提高IFN-γ檢測的敏感性可以增強(qiáng)對LTBI的檢測，特別是對免疫力低下的患者或兒童。

快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染對于預(yù)防和控制結(jié)核病是非常重要的，臨床上需要?jiǎng)佑枚喾N手段綜合分析，做出判斷。同時(shí)結(jié)核桿菌可長期以休眠狀態(tài)存活，并可被重新激活而致病，及早診斷潛伏結(jié)核感染者，是控制結(jié)核傳播的重要手段之一。目前，國內(nèi)以TST作為主要檢測手段，但TST的結(jié)果容易受到卡介苗和受試者免疫狀態(tài)的影響。國外常用的TIGRA檢測方法彌補(bǔ)了TST的上述缺點(diǎn)，但是不能區(qū)分活動性和潛伏性結(jié)核感染者。γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)，顯示出了很多超越TST的優(yōu)點(diǎn)，對于判斷結(jié)核分枝桿菌感染有可靠的參考價(jià)值，隨著方法的改進(jìn)以及新抗原的應(yīng)用，以后可能會成為新一代的診斷方法。